Inhibition of complex I of the electron transport chain causes O2-・-mediated mitochondrial outgrowth
【ミトコンドリア電子伝達系Ⅰの阻害はO2-調節性のミトコンドリアの樹状化を引き起こす】
背景:最近の酸化的ストレスはがんや老化様々な変性の病気の病因だと考えられている。酸化的ストレスは産生と無害化のバランスが見出された時に発生する。
課題: 哺乳類の細胞は様々な方法でこの状態に反応しており、ミトコンドリアの形態変化もその一つである。
目的: 当研究ではロテニンをミトコンドリア電子伝達系ⅠであるComplex1の阻害剤として使用した。阻害によって、O2-の産生が減ると考えられている。ミトコンドリアの酸化防止剤であるMitoQをO2-産生と形態変化に関係があるかどうかを調べるために用いた。
手法:ヒト皮膚線維芽細胞を用いた。ビデオレート共焦点顕微鏡で細胞の興奮をミトコンドリア特異性陽イオンローダミン123で、ミトコンドリア形態を自動化解析して見た。
結果:慢性的にロテノン（100 nM,72h）に暴露したものは細胞あたりのミトコンドリアの量は変化なしに、かなりミトコンドリアの伸長と樹状化が見られた。
結果②:加えて、この手法によってC11-BODYPY581/591によって決定される脂質過酸化反応が起きた。
結果③: 蛍光エチジウムを得るためにO2-よって酸化されたヒドロエチジンを添加して得た細胞を塩化ロテノンに暴露して得た顕微鏡のデジタルイメージングではO2-の生産率は２倍になった。MitoQはロテノン誘導性のエチジウムの形成を妨げないが、ロテノン誘導性の樹状化と膜の過酸化を消失させた。
考察:これらの発見はミトコンドリアのO2-の産生の増加は結論として、例えばcomplex Iの阻害がミトコンドリアの樹状化を引き起こし、MitoQがミトコンドリアの形態における交代を防ぐためにO2-をを減少させる。
イントロ:脳、心臓、筋肉、肝臓、内分泌性組織からとった高好気性細胞はエネルギー要求に合わせるためにそれらのミトコンドリアのATP産生能力に依拠する。細胞のエネルギー消費の激しい変化は好気性A T P産生に含まれる酵素のフィードバックと予測制御をし、塩基性の変化はミトコンドリアの能力と構造の交代を引き起こす。(3,22,35,36)細胞のミトコンドリアネットワークの目につく構造の変化は、細胞の成長と分裂の間の微妙な再編成が起こっているところで分化、老化、アポトーシスの間に観察される。(56)ミトコンドリアは酸化的リン酸化（OXPHOS）を通してATPを産生し、このシステムからの離脱はエネルギー産生量を減少させ、O2-の形成を増加させ、過酸化水素やOHのような反応的な酸素を得て、そして死を促進する要因を放出する。（44,47,56）欠陥は老化や癌などの様々な種類の変性疾患で起こり、主に高エネルギーを要求する組織に影響を与え、それらは減らされたミトコンドリアのエネルギーの供給に適応することができない。がんのようなそのような環境でも生きられる細胞はグルコース輸送、解糖、乳酸分泌の増加といった様々な種類の適応を示す。同時に、これらの細胞はミトコンドリア主に核周辺に存在しているにもかかわらず、ミトコンドリア含有量、OXPHOS能力の低下を示す。ガラクトースとグルタミンで成長することが強制された癌細胞は素早く嫌気的から好気的なエネルギー生産に変化する。この適応はOXPHOSの増加とミトコンドリアマトリックスのpHの低下、さらに酸化されたマトリックス酸化還元反応状態、クリステの量の増加が同時に起こるが、ミトコンドリアの量は変わらず、さらにミトコンドリアのネットワークが拡大する。類似した観察は最初に出芽酵母で観察され、それは基質の変化がミトコンドリアの量において３倍に増加した。(16)ミトコンドリアの質and/or量的な変化はミトコンドリアDNAまたは OXPHOS遺伝子に遺伝した変異によって引き起こされた病的な状態のもとで観察され、ミトコンドリアの形態と機能には強い相関があることが示唆された。(11)最近の洞察は、OXPHOSの過程で形成される副産物のO2-陰イオンが特異的な酸化還元の敏感なシグナル経路として働いているかもしれないということである。（13）エビデンスはタンパク質調節性のプロトンコンダクタンスによって提供されている。（7）加えてこれらの経路はミトコンドリアの生成と関係があり（29,32,33）、細胞の抗酸化能力を制御している。（40）充当する変化はO2-産生の増加を誘起すると考えられており、細胞の抗酸化能力気候によって適切にバランスが保たれていなければ構造的、そして機能的なダメージを脂質膜の多価不飽和脂肪酸、タンパク質、DNAに引き起こすかもしれない。それらは酸素のラジカル形成はアステローム動脈硬化症や主な神経変性、慢性炎症などの病因の良いエビデンスである。（21）さらには、急な形成の増加は老化とアポトーシスに関連がある。（17,31）しかしながら、組織の損傷が起こっている病気の大多数においてラジカル形成は原因よりも結果だとみなされている。人のミトコンドリアcomplex 1はOXPHOSのシステムである多サブユニットの集合であり、39のユニットが核にコードされており、7のユニットがミトコンドリアにコードされている。(23)これらの複合体の機能不全は様々な種類の臨床症候群に関連している。これらの病気の病態生理学の理解を高めるために、安定化（固定）またはそれらを取り除く（治療する）ための新しい手法の開発という最後の目的とともに、我々は遺伝的に特徴付けられたヒトcomplex1が不足した線維芽細胞をOXPHOSシステムの病気モデルとしてこれらの細胞が解糖であるという知識とともに研究した。(41)我々は、複合体のサブユニットの構造をコードしている核の変異によってcomplex1が不足している患者由来の皮膚線維芽細胞を用いた。アゴニスト（作動薬）誘導性ミトコンドリアCa2+蓄積とATP産生の確保の著しい減少が見られた。（53）Phamsさんたちは(39)、ミトコンドリアcomplex1が不足した患者由来の皮膚線維芽細胞においてミトコンドリアの形態と動態は変えられると報告した。5分間の（complex1阻害薬である）ロテノン（40μl）暴露によって類似した観察が見られた。患者から単離した線維芽細胞のミトコンドリア膜はヒトcomplex1不足においてNADH刺激性のミトコンドリアのO2-形成が増加したことを示した。また、10μMロテノンはこのコンロールした膜において急にラジカル形成を増加した。ヒト肺線維芽細胞において過酸化水素がミトコンドリアの量を増やす外因性の適応とともにみると、これらの発見は、complex1の不足において増加したミトコンドリアのO2-形成とミトコンドリアの変化、動態は因果関係を示唆している。しかしながら決定的な証拠は未だ得られていない。
本研究では慢性的な電子伝達系のcomplex1の阻害（100nMロテノン72h）によって引き起こされたミトコンドリアのO2-の持続された増加はミトコンドリアの長さと樹状化の増加を引き起こした。
マテメソ:fleshlyなMitoTrackerをDMSOで溶いて5μMで3分間染色のちにWashしている。また、使っている対物レンズは40倍油浸レンズ。
画像取得前に輝度とコントラストを最適化した、カスタムルックアップテーブルを用いた。これは、下位から上位まで10段階のグレーレベルの色に赤と青でそれぞれなっている。画像サイズは512*480ピクセル。これらの画像は100nsの滞留時間30Hzで集められた。
あああー
Dの先輩に読んでおいて、って言われたけど、途中で萎えたし、え、ほんとに読んだの、みたいな感じだったので辛み。それからだってこれ確か2005年とか古かったよね、とか言い出すしなんなん、ってなっちゃった笑
自分のこと最近の若者、とはあんまり思ってなかったけれど、確かに、なんか縛られて、指示出されるの待つとか、脳死状態で何かするのが嫌な気がする。。。
最近の若者だったんかな、私は笑
何が問題か、って画像処理のやり方なので、画像処理の勉強と共焦点顕微鏡についての勉強が必須ですね汗
焦らず、やってこう。
